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内标定量与外标定量比照？

2016-07-07 16:23
  由于古板定量要领都是终点检测，即PCR抵达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增抵达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差别，因此无法直接从终点产品推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产品定量所造成的禁绝确性。但纵然如此，古板的定量要领也都只能算作半定量、大概定量的要领。  内标定量：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，他们之间保存两种模板之间的滋扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会体现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标，也正是这个原因，古板定量要领虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的要领。  外标定量：外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是与被测样品在相同条件下进行检测。由于在荧光定量PCR中，Ct值与起始模板的对数保存线性关系，因此可以利用标准曲线对未知样品进行定量测定，并且在PCR循环刚刚进入真正的指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一模板差别时间扩增或同一时间差别管内扩增，获得的Ct值是恒定的，因此定量的结果也会准确许多。  美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的要领学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量要领是一种准确的、值得信赖的科学要领。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】
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